人IL-10基因重组复制缺陷型腺病毒DNA的构建

目的 构建人IL-10基因的重组腺病毒并进行体外表达和检测。方法从质粒pcDNA3IL-10的CMV启动子下游完整切下IL-10 cDNA的片段,将其定向插入Gateway载体,在克隆酶的作用下将阳性克隆质粒转入目的腺病毒载体。PacI酶线性化IL-10腺病毒DNA后阳离子质脂体转染293A细胞,获得人IL-10的复制缺陷型重组腺病毒。体外感染人胰腺癌细胞株Bxpc-3和大鼠胰腺细胞株AR-42J;Western blot检测人IL-10的表达。结果 成功地构建人IL-10重组腺病毒,病毒滴度达2×109PFU/mL。体外感染的细胞株均检测到IL-10的表达。结论 构建复制缺陷型重组腺病毒能够介导IL-10的基因表达,为细胞因子的抗炎冶疗奠定实验基础。     

人核糖体小亚基蛋白24剪接变异体mRNA在胃癌中的表达

目的探讨人核糖体小亚基蛋白(RPS)24剪接变异体mRNA在胃癌中的表达及其意义。方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)结合剪接位点特异性引物技术,检测60例胃癌和7例胃溃疡标本中RPS24剪接变异体mRNA表达情况,并分析其与临床病理因素的关系。结果 所有的胃癌和胃溃疡标本中均出现RPS24a mRNA表达;而RPS24c mRNA在胃癌组织表达率为96.7％,癌旁正常黏膜为11.7％;并且低、未分化型胃癌、淋巴结转移≥5个、TNMⅢ、Ⅳ期病例的RPS24c mRNA表达比率分别显著高于分化型胃癌、淋巴结转移<5个、TNM Ⅰ、Ⅱ期胃癌病例(P<0.05)。胃癌组织中RPS24 mRNA的总体表达水平显著高于癌旁正常黏膜(P<0.01),而且TNMⅢ、Ⅳ期胃癌中RPS24 mRNA表达水平显著高于Ⅰ、Ⅱ期胃癌(P<0.05);胃溃疡中RPS24mRNA的表达水平与正常胃黏膜差异无显著性(P>0.05)。结论RPS24剪接变异体的异常表达与胃癌的发展、转移有关,可作为胃癌生物学行为评估和判断预后的指标。     

肝细胞生长因子在左肾动脉狭窄大鼠心血管中的表达及干预研究

目的　观察左肾动脉狭窄肾性高血压大鼠模型心肌和血管中肝细胞生长因子 (HGF)的表达 ,并观察缬沙坦和螺内酯对其表达的影响。方法　选用 6周龄SD大鼠 2 4只 ,制备左肾动脉狭窄肾性高血压模型 ,分为 4组 ,分别为手术组、假手术组、缬沙坦组、螺内酯组。治疗组分别用缬沙坦 3 0mg/kg·d-1、螺内酯 2 0mg/kg·d-1溶于饮水灌胃 ,1次 /d ,连续治疗 17周。用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)法检测大鼠心肌和血管HGFmRNA水平。结果　 17周后 ,缬沙坦组和螺内酯组的心肌HGFmRNA/ β actinmRNA(1.17± 0 .0 8/ 0 .85± 0 .0 8)高于手术组 (0 .5 7± 0 .0 7) (P <0 .0 1) ,但低于假手术组 (1.3 5± 0 .0 9) (P均 <0 .0 1)。两治疗组肠系膜动脉HGFmRNA水平高于手术组 (P <0 .0 1) ,但低于假手术组 (P均 <0 .0 1)。结论　缬沙坦和螺内酯均能使左肾动脉狭窄肾性高血压大鼠心肌和血管中的HGF升高 ,同时伴有心肌和血管重塑的改善 ,说明HGF在左肾动脉狭窄肾性高血压大鼠的靶器官保护中起着重要作用     

膜表达热休克蛋白70真核表达载体的构建及其对肿瘤细胞的转染

目的构建普遍适合性的膜表达热休克蛋白70(HSP70)的真核表达载体,修饰并建立HSP 70表达并结合在细胞膜表面的肿瘤细胞.方法RT-PCR法从人胚肾中获取HSP 70的cDNA,扩增成带酶切位点的目的基因.选择载体pDisplay,将目的基因插入载体多克隆酶位点中.DNA测序证实后,以脂质体转染的方法,将载体转染到黑色素瘤细胞.用G418抗性筛选获得阳性克隆.结果酶切电泳和DNA测序证实载体构建正确;目的基因的上游带信号肽序列,下游带跨膜序列.RT-PCR产物电泳、Westem Blotting、激光共聚焦显微镜和流式细胞术证实大量HSP 70表达并结合在转染的黑色素瘤细胞膜表面.结论成功地构建了膜表达HSP 70的真核表达载体;转染到黑色素瘤细胞后,细胞膜表面表达丰富的HSP70.转染细胞可以进一步制备新型瘤苗.     

An Integrated Technique for Identification of Differential Genes Expressed in Patients with Cancer

Summary: To develop a method for identification of differential gene expression between different cell populations, several convenient techniques of molecular biology, including subtractive hybridization, suppression PCR, T/A cloning and sequencing, were used to identify genes expressed differentially in CD45^- and CD45^- cells isolated from U266 cell line of multiple myeloma. Our results showed that the levels of abundant genes scale down 20 times through subtractive hybridization.Plasmid DNA from CD45^- cell clones was hybridized with forward or backward cDNA probes synthesized from CD45^- and CD45 cells, respectively. A few of differentially expressed genes reconfirmed by RT-PCR were identified from 500 expressed clones of CD45^- cells. It is concluded that a strategy for gene expression identification developed from conventional molecular biological methods can be used in different laboratories.     

p38丝裂原激活蛋白激酶对人胚胎肾293细胞一氧化氮合酶基因转录的调控

目的探讨p38 丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)家族四种亚型对诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因的转录调控。方法以人胚胎肾293(HEK 293)细胞为靶细胞,采用脂质体(LPS)介导的细胞基因共转染技术、荧光素酶报告基因技术,分别将FLAG-tagged p38 MAPK 4种亚型、含有鼠iNOS基因启动子区的荧光素酶报告基因质粒(piNOS-Luc)、空载体(pcDNA3)、β-半乳糖苷酶表达质粒(pCMV-β)共转染,检测并比较荧光素酶相对活性。结果(1)未加刺激时,在HEK 293细胞中,p38 MAPK中仅有p38α能够诱导iNOS基因启动子的转录活性;(2)在LPS刺激下,p38 MAPK 4种亚型均能够诱导iNOS启动子的转录活性,其中,p38β所诱导的转录活性最高,p38α的诱导作用亦很明显。结论(1)LPS能够在HEK 293细胞中诱导iNOS基因转录活性;(2)在HEK 293细胞中,p38 MAPK参与了静息时及LPS刺激下对iN-OS基因的转录调控。     

子宫内膜癌组织中p16 mRNA及P16蛋白的表达

①目的　探讨抑癌基因 p16与子宫内膜癌发生、发展的关系。 ②方法　应用逆转录聚合酶链反应(RT PCR)和免疫组织化学技术 ,对 4 2例子宫内膜癌及 15例正常子宫内膜组织中 p16mRNA及P16蛋白进行检测 ,并结合临床病理特征进行分析。③结果　子宫内膜癌组织中p16mRNA及P16蛋白的阳性表达率分别为6 9.0 5 %和 5 9.5 2 % ,显著低于正常组织 (χ2 =6 .0 15、8.6 2 5 ,P <0 .0 5 )。p16mRNA及P16蛋白的表达缺失与肿瘤的组织学类型无关 (χ2 =0 .10 0、0 .2 94 ,P >0 .0 5 ) ,而与组织学分级和临床分期有关 (χ2 =3.95 4、6 .873,P <0 .0 5 )。④结论　p16mRNA和P16蛋白的表达缺失在子宫内膜癌的发生和发展中可能起重要作用     

脂多糖刺激树突状细胞前后TLR2、3、4基因表达的检测

目的 检测脂多糖作用于树突状细胞前后TLR2、3、4基因的表达情况。方法 从外周血分离单核细胞，加入rhGM-CSF及rhIL-4，培养的第6天，实验组加入脂多糖刺激24h，对照组不加。分别提取细胞总RNA，行半定量RT-PCR，产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。结果 单核细胞经GM-CSF及IL-4诱导7d后的DC表达较高水平TLR2、3、4。脂多糖刺激24h后，TLR2、3、4表达下降，TLR4几乎测不到。结论 树突状细胞在受脂多糖刺激前后TLRs的表达有显著变化，推测和它的功能成熟有关。     

Identification of differentially expressed genes in omental adipose tissues of obese patients by suppression subtractive hybridization

To identify differentially expressed genes between obese individuals and normal control, we have undertaken suppression subtractive hybridization （SSH）. Omental adipose tissues were obtained via abdominal surgery for appendicitis in both 13 obese subjects[BMI （body mass index） 〉 30 kg/m（2）] and 13 normal subjects （BMI 〉 18 and 〈 25 kg/m（2））.     

反式二羟环氧苯并芘对人支气管上皮细胞中HER2/neu基因表达的影响

目的探讨环境致癌物苯并(a)芘代谢物反式二羟环氧苯并芘(BPDE)对人支气管上皮细胞HER2/neu基因表达的影响。方法利用半定量RT-PCR、SYBR GreenI实时定量RT-PCR(QRT-PCR)、Western blot及免疫细胞化学方法分别检测经2.0μmol/L反式BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化细胞(16HBE-T)与对照DMSO溶剂组未恶性转化细胞(16HBE-N)之间HER2/neu基因mRNA和蛋白表达水平的差异,及两组细胞内HER2/neu蛋白表达定位分析。结果经几种不同方法检测反式BPDE恶性转化人支气管上皮细胞中HER2/neu基因mRNA和蛋白水平都比对照溶剂组细胞(16HBE-N)表达显著升高(P<0.05)。HER2/neu蛋白定位在胞膜。结论反式BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化存在HER2/neu表达增高,其可能与原癌基因HER2/neu被激活作用有关。